作者：宋詩穎、崔瀠心、凌霞、葉曉霞、樂健、許旭

他克莫司軟膏浸沒池體外釋放評價方法的研究

摘 要

目的：建立他克莫司軟膏體外釋放評價方法，比較國內(nèi)仿制制劑和參比制劑的體外釋放行為一致性。

方法：采用A型浸沒池建立他克莫司軟膏的體外釋放方法，選擇無水乙醇-生理鹽水（30∶70）為釋放介質，孔徑0.45μm的聚四氟乙烯膜為人工膜，轉速200r·min-1。以液相色譜-串聯(lián)質譜法測定釋放量，采用Agilent Zorbax SB C18（150mm×2.1mm，3.5μm）色譜柱，以 0.1%甲酸溶液（含5mmol· L-1甲酸銨）（A）-甲醇溶液（B）為流動相，梯度洗脫，柱溫55 ℃，進樣體積10μL。測定他克莫司仿制制劑與參比制劑的釋放量，并計算釋放速率。采用基于Wilcoxon的秩檢驗和Mann-Whitney U檢驗的統(tǒng)計學方法計算仿制制劑與參比制劑的釋放速率比值的90%標準置信區(qū)間，評價仿制與參比他克莫司軟膏體外釋放一致性。

結果：所建檢測方法檢測限達到0.026ng· mL-1，回收率在 92.6%~99.3%。2家國產(chǎn)他克莫司軟膏仿制制劑中，仿制制劑1與參比制劑的釋放速率比值的90%置信區(qū)間為97.92%~122.19%，在75.00%~133.33%范圍內(nèi)，顯示體外釋放速率與參比制劑一致，初、復試中仿制制劑2與參比制劑供試品釋放速率比值的90% 置信區(qū)間均超出 75.00%~133.33%的范圍，表明仿制制劑2的體外釋放速率與參比制劑不一致。浸沒池方法的研究結果與擴散池方法的研究結果一致。

結論：本文所建方法符合他克莫司軟膏體外釋放評價要求且結果可靠，浸沒池體外釋放法可用于他克莫司軟膏的體外釋放行為評價。

 關 鍵 詞

01   引 言

他克莫司是一種具有免疫作用的23元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，能有效抑制T淋巴細胞的鈣調神經(jīng)磷酸酶激活。其相對分子質量較小，口服吸收能力差，可以制成半固體制劑局部用藥治療特異性皮炎、銀屑病等皮膚病。他克莫司軟膏是全世界首個獲得批準上市的非皮質固醇激素類外用免疫抑制調節(jié)劑。目前，國內(nèi)有十余家企業(yè)生產(chǎn)他克莫司軟膏。

半固體制劑中活性成分體外釋放的程度和速度受到原料藥溶解度、粒徑以及制劑的流變學性質等多個物理和化學參數(shù)的綜合影響。外用半固體的體外釋放試驗（in vitro release test，IVRT）是表征和評價半固體制劑性能的有效手段，也用于藥品開發(fā)過程中處方工藝的篩選研究。體外釋放試驗作為外用半固體制劑關鍵的體外質量研究項目，對于外用半固體仿制制劑質量研究與評價具有重要參考作用?！镀つw外用化學仿制藥研究技術指導原則（試行）》 明確指出皮膚外用化學仿制藥應開展體外釋放研究。浸沒池已用于環(huán)孢菌素眼用軟膏、酮康唑乳膏的體外釋放研究。褚信信等采用流通池開展復方克霉唑乳膏的體外釋放研究。USP 2024推薦擴散池、浸沒池用于半固體制劑體外釋放研究，2020年版《中華人民共和國藥典》暫無半固體制劑體外釋放研究的相關要求和規(guī)定。擴散池是半固體制劑體外釋放常用的方法。他克莫司軟膏的體外釋放研究多采用擴散池法進行，采用浸沒池法開展他克莫司軟膏的體外釋放研究暫未見文獻報道。

本文通過對釋放條件的篩選建立他克莫司軟膏浸沒池體外釋放測定方法，采用液相色譜- 串聯(lián)質譜檢測釋放量，并完成相關方法學驗證。以所建方法考察2家企業(yè)生產(chǎn)的他克莫司軟膏仿制制劑與參比制劑的體外釋放行為，并進行體外釋放一致性評價，為他克莫司軟膏質量的一致性評價提供新方法。本研究也將為浸沒池法在其他外用半固體制劑體外釋放評價中的應用提供經(jīng)驗。

02   儀器與試藥

Agilent 1290-6490 超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質譜儀，Agilent 公司；DS-1206AT自動取樣溶出系統(tǒng)及A 型浸沒池，深圳市華溶分析儀器有限公司；0.45μm聚四氟乙烯親水膜，龍津公司；Waters 2695高效液相色譜儀，Waters公司；透皮擴散儀（推薦使用華溶儀器TD-12AT Pro透皮擴散系統(tǒng)）。

他克莫司對照品（批號TAB0220803，純度95.3%），海正藥業(yè)；他克莫司軟膏（參比制劑，批號C73736，規(guī)格10g∶1 0mg），安斯泰來制藥有限公司；他克莫B司軟膏（仿制制劑。T1∶A公司，規(guī)格10g∶10mg；T2∶公司，規(guī)格10g∶10mg）；氯化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；乙醇（色譜純）、甲酸（質譜級）、甲醇（色譜純）、四氫呋喃（色譜純），Merck 公司；甲酸銨（質譜級），CNW 公司。

03   方法與結果

3.1  浸沒池體外釋放

A型浸沒池，詳見圖1。借助調整工具調節(jié)樣品室體積以控制上樣量。

圖1　浸沒池結構（右）及其在溶出杯中（左）的示意圖

采用A型浸沒池與帶有自動取樣器的溶出儀，以預先超聲脫氣的無水乙醇-生理鹽水（30∶70）100mL作為釋放介質。取樣品約0.50g，填充至浸沒池樣品室內(nèi)，均勻涂布，精密稱定，控制上樣量偏差在±5%范圍內(nèi)。將人工膜覆于樣品表面，用固定環(huán)固定后，將浸沒池放入已裝有釋放介質的溶出杯中，轉速 200r· min-1，水浴溫度（32±0.5）℃，于0.5、1、2、3、4、5、6h時，分別取釋放液3mL，并及時補充相同體積的釋放介質。

3.2  色譜- 質譜條件

3.2.1　色譜條件

采用Agilent Zorbax SB C18（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）色譜柱，以0.1%甲酸溶液（含5 mmol· L-1甲酸銨）（A）-甲醇溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0~0.5 min，20%A；0.5~5.0min，20%A→5%A；5.0~7.0min，5%A→0%A；7.0~9.0min，0%A），流速0.3mL · min-1，柱溫55 ℃，進樣體積10μL，樣品室溫度6 ℃。

3.2.2　質譜條件

采用ESI源，正離子掃描模式，監(jiān)測模式為多反應監(jiān)測，以m/z 821.6 →768.5（碰撞電壓為15V）為定量離子對，以m/z 821.6→786.6（碰撞電壓為10V）為定性離子對。

3.3  溶液制備

3.3.1　對照品溶液

取他克莫司對照品約10mg，精密稱定，置20mL量瓶中，加四氫呋喃適量使溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL中約含他克莫司0.5mg的溶液，作為儲備液（4 ℃條件下，可放置1個月）。精密量取儲備液適量，用無水乙醇-生理鹽水（30∶70）逐步稀釋制成每1mL中含5、10、50、100、150、200、250ng的溶液，作為對照品溶液。靜置4h，待異構體轉化平衡后進樣。

3.3.2　供試品溶液

取他克莫司軟膏體外釋放試驗中各時間點的釋放液，即得。

3.4　方法學考察

3.4.1　線性與范圍

取“3.3.1”項下系列濃度對照品溶液，按“3.2”項下條件進樣測定，計算他克莫司峰面積（Y）與對應濃度（X）的線性方程Y=34 406X+182025 r=0.9996表明在5.12~255.80ng· mL-1濃度范圍內(nèi)，他克莫司的質譜響應與質量濃度之間線性關系良好。

3.4.2　進樣精密度

取“3.3.1”項的5、50、100 ng· mL-1對照品溶液，分別連續(xù)進樣6次，測定峰面積，他克莫司峰面積的RSD（n=6）分別為0.93%、1.1%和0.29%，均＜2.0%，表明液質聯(lián)用法進樣精密度良好。

3.4.3　檢測限和定量限

精密量取5ng·mL-1的對照品溶液，加入適量釋放介質逐級稀釋。按“3.2”項下條件測定，以信噪比為3時的濃度為檢測限，以信噪比為10 時的濃度為定量限，他克莫司的檢測限為 0.005 ng· mL-1（相當于最低釋放濃度的0.03%），定量限為 0.026 ng· mL-1（相當于最低釋放濃度的0.90%），靈敏度符合他克莫司軟膏釋放量測定要求。

3.4.4　回收率

取試驗后所得釋放液（質量濃度為121.14 ng· mL-1）1.0、2.0、5.0、5.0 mL，分別置于10mL量瓶中，再分別加入新配制的511.57 ng· mL-1他克莫司對照品儲備液0.2、0.6、1.0、2.0 mL，用釋放介質稀釋至刻度，搖勻，作為20%、50%、100% 和150% 回收率溶液，一式3份。按“3.2”項下條件測定峰面積，計算回收率?；厥章史謩e為96.7%（RSD=1.5%），86.2%（RSD=0.41%）、92.8%（RSD=1.1%）、96.2%（RSD=0.50%）。表明輔料/基質對樣品的體外釋放測定沒有干擾。

3.4.5　溶液穩(wěn)定性

取釋放液3份于（34±0.5） ℃的水浴條件下放置16、24h，按“3.2”項下條件測定釋放液放置前后他克莫司的濃度。放置16、24h后他克莫司濃度與初始濃度比值分別為101.3%、100.4%，表明供試品溶液在34 ℃的溫度條件下，24h內(nèi)穩(wěn)定。取對照品溶液于6 ℃下放置168h，按“3.2”項下條件測定，168h后他克莫司濃度與初始濃度比值為101.52%，表明對照品溶液在6 ℃條件下168h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.6　釋放精密度

分別取參比制劑樣品約0.50g，一式6份，精密稱定，按“3.1”項下方法及“3.2”項下條件測定累積釋放速率。連續(xù)2d重復測定，得到12組累計釋放量結果。12條擬合直線相關系數(shù)r均＞0.94，釋放速率為10.3%，日內(nèi)精密度為8.4%，日間精密度為9.0%，RSD 均＜10%。因此，建立的測定方法符合他克莫司軟膏的體外釋放測定的精密度要求。

3.4.7　物料平衡

取試驗結束后的剩余膏體與人工膜（共6組），用加熱至60 ℃的四氫呋喃20mL分次將殘留軟膏溶解并轉移至50 mL量瓶中，用加熱至60 ℃的四氫呋喃10mL分次淋洗墊片、浸沒池樣品室部分、人工膜，合并洗液至同一50 mL量瓶中，加水10mL，小心振搖成混懸液，用無水乙醇稀釋至刻度，劇烈振搖，冷藏30min，4000r· min-1離心10min，精密量取上清液1mL，置50mL量瓶中，用釋放介質稀釋至刻度，搖勻。精密量取1mL置10mL量瓶中，用釋放介質稀釋至刻度，搖勻，作為殘留膏體供試液。將殘留膏體供試液按“3.2”項下條件測定峰面積，計算膏體中他克莫司殘留量。膏體中殘留量及累積釋放量二者之和與初始上樣量相比較，計算物料平衡。6組結果分別為96.16%、95.12%、92.56%、93.45%、99.27%和96.17%，均在90%~110%的范圍內(nèi)，表明實驗過程中，他克莫司未出現(xiàn)物料流失，結果可靠。

3.5　樣品測定

取仿制制劑與參比制劑，按“3.1”項下方法制備釋放液，按“3.2”項下條件測定釋放曲線（仿制制劑與參比制劑交替上樣），仿制制劑與參比制劑的單位面積累積釋放曲線見圖2、3。

圖2　參比制劑與T1 的單位面積累積釋放曲線

圖3　參比制劑與T2 的單位面積累積釋放曲線

仿制制劑與參比制劑的一致性采用基于Wilcoxon的秩檢驗和Mann-Whitney U檢驗統(tǒng)計學方法進行。求出仿制制劑與參比制劑釋放速率中位數(shù)差異90%置信區(qū)間，然后進行一致性判斷。

分別計算T1與參比制劑的釋放速率，并計算二者的比值，結果見表1。

表1　T1 與參比制劑的體外釋放速率比值

將表1中36個比值按升序排列，第8個和第29個比值分別是T1的中位體外釋放率（斜率）與參比制劑的中位體外釋放率比值的90% 置信區(qū)間的下限和上限，本實驗中90%置信區(qū)間為97.92%~122.19%，在75%~133.33% 范圍內(nèi)，表明T1與參比制劑的釋放速率等同。

在T2與參比制劑的對比實驗中，初試的90% 置信區(qū)間為115.10%~152.89%，不在75%~133.33%范圍內(nèi)。重復進行2次試驗，增加T2與參比制劑各12個斜率，2種樣品各18個斜率進行釋放速率比值計算。

324個數(shù)據(jù)進行升序排列，位于第110位和第215位的比值分別是T2的中位體外釋放率與參比制劑的中位體外釋放比率比值的90%置信區(qū)間的下限和上限。復試試驗中90%置信區(qū)間為115.87%~135.29%，仍然不在75%~133.33%，表明T2 與參比制劑的釋放速率不等同。

04  分析與討論

4.1　檢測方法選擇

他克莫司軟膏的規(guī)格小，含量僅為0.1%，且釋放量低，他克莫司HPLC紫外檢測的檢測限約為0.1μg，難以滿足釋放量測定要求。因此采用靈敏度更高的三重四極桿質譜檢測器進行他克莫司釋放量的測定。

4.2　人工膜的選擇

從對藥物無阻滯作用與無吸附作用2個方面進行考慮。選用0.45μm尼龍膜、0.45μm聚四氟乙烯親水膜（PTFE 親水膜，光滑面接觸膏體）和0.45μm聚四氟乙烯疏水膜（PTFE疏水膜，光滑面接觸膏體），分別取參比制劑樣品0.50g，按“3.1”項下方法及“3.2”項下條件測試。PTFE親水膜、PTFE疏水膜、尼龍膜6h釋放液濃度分別為1.0121、0.3502、0.8752μg·mL-1，表明PTFE親水膜對藥物的阻滯性最小。

取“3.3.1”項下配制的100ng· mL-1對照品溶液于試管中，分別加入0.45μm尼龍膜和0.45μmPTFE親水膜，放置24h后，輕取上層清液，按“3.2”項下方法測定峰面積，計算24h后溶液中他克莫司含量的變化。結果PTFE親水膜和尼龍膜釋放液與對照原液濃度比值分別為97.8%、92.3%，表明PTFE親水膜對他克莫司的吸附性最弱。

對膜正反面的阻滯性差異進行研究。以PTFE親水膜的不同面接觸樣品表面，使用墊片與固定環(huán)固定。按“3.1”項下方法及“3.2”項下條件測定累積釋放量并繪制釋放曲線，見圖4。顯示光滑面接觸軟膏時，PTFE 親水膜對釋放的阻滯效用最弱。

圖4　PTFE 親水膜正反面比較

綜合以上結果，選擇0.45μm PTFE 親水膜為人工膜，且使用時光滑面朝下接觸膏體。

人工膜的選擇是體外釋放方法建立的重要步驟，理想狀態(tài)下人工膜對軟膏應僅具支撐作用，對藥物釋放沒有阻滯影響。常見的PTFE膜因氟原子極化率低和結構特性，持久親水性不強。本研究所選用的PTFE親水膜采用親水改性方法使得PTFE膜正反兩面表觀不一致，正面有涂層，表面平整光滑，反面沒有涂層，表面粗糙，肉眼可見纖維縱橫交錯。實驗中發(fā)現(xiàn)反面（粗糙面）接觸軟膏時，膜對他克莫司的釋放有明顯的阻滯作用。可能是由于粗糙面接觸軟膏時交錯的疏水纖維容易形成微小空隙，釋放過程中空隙內(nèi)殘留的空氣影響介質和膏體的充分接觸，從而表現(xiàn)出單向阻滯性。而親水改性的正面（光滑面）接觸膏體時，介質充分接觸膏體，保證了藥物的釋放。

4.3　釋放介質的選擇

釋放試驗中的釋放介質應模擬實際生理條件，如生理鹽水、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）等。由于他克莫司在磷酸鹽緩沖液中不穩(wěn)定，因此選用生理鹽水。他克莫司難溶于水，在水溶液中溶解度低，因此在釋放介質中加入一定量無水乙醇提高他克莫司軟膏在釋放介質中的釋放量。試驗發(fā)現(xiàn)，當釋放介質中有機相比例提升，他克莫司軟膏的釋放量增加，但當無水乙醇- 生理鹽水的比例達到40∶60時，他克莫司降解產(chǎn)生雜質，影響釋放量檢測。

漏槽條件是體外釋放試驗必須滿足的條件之一，藥物在釋放液中的溶解度應為釋放液中藥物最高濃度的3~5倍。經(jīng)檢測他克莫司在無水乙醇- 生理鹽水（30∶70）中的溶解度為1.44 mg· mL-1，實驗中釋放液的最大質量濃度為115 ng· mL-1，滿足漏槽條件。

綜上結果，選擇無水乙醇-生理鹽水（30 ∶ 70）100 mL作為釋放介質。

4.4　轉速的選擇

按“3.1”項下方法，比較150和200r· min-1 2種轉速的差異。2種轉速下，6h測得釋放液質量濃度分別為0.0849和0.1037μg· mL-1，表明當轉速較高時，他克莫司軟膏的釋放速率更快。

4.5　取樣時間的選擇

按“3.1”項下方法，于0.5、1、2、3、4、5、6、9、12、15與18h取樣，按“3.2”項下條件測定峰面積，計算累積釋放量并繪制釋放曲線，結果顯示他克莫司軟膏釋放緩慢，18h累計釋放量僅有2.8%。經(jīng)計算，釋放過程符合Higuchi方程。釋放曲線線性部分應至少取5~6個時間點，因此確定取樣時間點分別為0.5、1、2、3、4、5 和6h。

4.6　與擴散池法的對比

與實驗室前期建立的他克莫司軟膏Franz擴散池體外釋放測定法進行對比驗證。

采用改良的Franz立式擴散池進行測定，以無水乙醇- 生理鹽水（30∶70）12 mL 作為釋放介質，攪拌速度 400 r· min-1，介質溫度（32±0.5）℃，經(jīng)0.5、1、2、3、4、5和6h時取釋放液4mL，取樣后補充相同體積的釋放介質。

精密稱取他克莫司軟膏0.3g，放置于墊有PTFE親水膜的2mm厚定量環(huán)中，均勻涂布并保證表面平整。將完成稱量的定量環(huán)放置并固定在擴散池上，依照上述條件試驗（仿制制劑與參比制劑交替進樣），各時間點釋放液即為供試品溶液。

精密量取“3.3.1”項下他克莫司儲備液適量，用釋放介質定量稀釋為每1mL中含他克莫司0.5μg的對照品溶液。靜置4h，待異構體轉化平衡后進樣。

采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent Zorbax SB色譜柱，150mm×4.6mm，5μm），以水-異丙醇- 四氫呋喃（5∶2∶2）為流動相，檢測波長為220nm，流速1.0mL · min-1，進樣體積100μL，樣品室溫度5 ℃，柱溫60 ℃。理論板數(shù)按他克莫司峰計算應不低于2 000。精密量取對照品溶液與供試品溶液各100μL進樣測定。

按上述試驗條件進行參比制劑與T1、T2的測定。2種方法測定結果匯總如表2，2種釋放測定方法的等效性評價結果一致。

表2　不同體外釋放方法結果對比

05   結 論

體外釋放試驗可以反映半固體制劑中藥物的微觀結構與流變學性質等理化參數(shù)的綜合作用，適用于多種場景。對于仿制制劑而言，可用于評估與參比制劑間的一致性，作為仿制制劑的生物等效性研究豁免依據(jù)之一。本研究針對他克莫司軟膏體外釋放評價方法的建立與應用展開研究，建立了他克莫司軟膏的體外釋放浸沒池評價方法。方法學驗證結果表明所建方法具有良好的區(qū)分力，結果準確，可用于他克莫司軟膏的體外釋放一致性評價。將所建方法應用于不同企業(yè)生產(chǎn)的仿制制劑與參比制劑的一致性評價。經(jīng)試驗研究與統(tǒng)計學分析，T1與參比制劑的釋放速率等同；而T2與參比制劑的釋放速率不等同。

擴散池法是目前應用較多的半固體制劑體外釋放評價方法，浸沒池的相關文獻則較少。本研究將浸沒池法與擴散池法評價結果進行對比驗證，結果表明，2種釋放方法的一致性評價結果相同。本研究所建立的浸沒池法評價方法可用于他克莫司軟膏的體外釋放評價。

實驗中發(fā)現(xiàn)浸沒池的方法精密度略低于擴散池法的精密度，可能與浸沒池裝置本身結構較為復雜以及影響因素較多有關，如不同浸沒池之間的系統(tǒng)誤差、浸沒池的密封性等，有待于在實驗中不斷認識和改進。

本研究為他克莫司軟膏的質量一致性評價提供了新的體外釋放評價方法，并為半固體仿制制劑的體外釋放試驗的裝置選擇積累了數(shù)據(jù)與經(jīng)驗。

06  參考文獻

略

07   溶出度與釋放度測定法

華溶五大溶出系統(tǒng)產(chǎn)品