時間:
翻譯：華溶應用中心
審核：工業藥劑發燒友
Doxil?是FDA批準的一種復雜靜脈注射多柔比星（DOX）脂質體制劑。對于多柔比星脂質體仿制藥，分析DOX的釋放曲線對于質量控制和可比性研究非常重要。然而，尚無可靠的多柔比星脂質體標準藥物釋放試驗。在本研究中，我們闡述了一種基于USP-4裝置的分析方法，能夠根據釋放曲線區分DOX脂質體制劑。在37℃的生理條件下，脂質體的DOX釋放有限，從而阻礙了測定方法的建立。向釋放介質中添加NH4HCO3有助于DOX釋放，這與添加的鹽濃度成比例，但這會導致釋放的藥物在流池法裝置中沉淀。在釋放介質中加入羥丙基環糊精 (HP-CD) 可避免DOX沉淀。我們通過改變HP-CD濃度、試驗溫度和試驗樣品濃度等參數，優化了DOX釋放的條件。優化的釋放介質包括：100mM NH4HCO3、75mM 2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES）和5%（w/v）HP-CD、5%（w/v）蔗糖、0.02%（w/v）NaN3（pH6）。在45℃下進行藥物釋放試驗，優化的釋放試驗可以區分不同處方、不同理化性質以及通過不同生產工藝制備的DOX脂質體制劑，這表明，該分析方法可用于比較DOX仿制藥與創新藥Doxil?的DOX釋放。
Doxil?是一種多柔比星脂質體制劑，最初于1995年獲得FDA批準，用于治療不同的惡性腫瘤，如艾滋病相關的卡波西肉瘤、復發性卵巢癌、轉移性乳腺癌和多發性骨髓瘤。Doxil?由美國強生公司(J&J) 銷售，于2010年失去專利保護。Doxil?生產高度復雜，涉及多個工藝，包括形成多層載體、擠出形成單層脂質體、將多柔比星主動載入脂質體、緩沖液交換/純化、無菌過濾和瓶裝。由于產品的復雜性，該產品的仿制藥發展受到限制。2013年，由Sun Pharma（印度）生產的第一款參照Doxil?的仿制藥鹽酸多柔比星脂質體注射液（如Doxil?）被美國FDA批準進口。多項分析測試以評估Doxil?及其仿制藥的理化等效性。FDA關于多柔比星脂質體注射液仿制開發的個藥指南，強調體外泄漏測試“以支持在一系列生理條件下沒有不受控制的泄漏并向腫瘤部位細胞遞送等效藥物”。與可獲得藥典標準釋放試驗的常規劑型不同，對于復雜脂質體產品（如Doxil?），目前尚無藥典標準釋放試驗，因此難以進行實驗室間對比和脂質體仿制藥的開發。因此，非常需要開發用于檢測Doxil?等復雜脂質體制劑藥物泄漏的標準釋放試驗。
流池法溶出儀近期已用于微粒和脂質體制劑的釋放研究，結果令人鼓舞。因此，我們的目標是開發多柔比星脂質體的USP-4體外釋放方法。與傳統的釋放試驗(例如透析袋和“取樣和分離”方法）相比，流池法釋放試驗用于多柔比星脂質體的優點包括：(a)使用標準流池法溶出裝置；(b)易于調節釋放試驗的不同參數(如溫度、流速和檢測波長)的能力；(c)在線UV檢測器連續自動檢測多柔比星的釋放，無需取樣。總體而言，這些優勢有助于建立穩健的釋放試驗，該試驗受操作誤差的影響較小，并且可在多柔比星脂質體產品生產商之間輕松轉移。
在當前研究中，我們開發了流池法多柔比星脂質體釋放試驗，能夠區分不同脂質體組成以及相同組成但通過不同工藝制備的制劑。在加速條件下，當超過70%的藥物在24小時內釋放時，已建立的流池法釋放試驗評估了多柔比星的滲漏。通過優化樣品與釋放介質的比例、溫度、組成（如緩沖液組分）、氨離子加入量以及多柔比星受體環糊精的加入量，建立了測定方法。該方法可用于評估批與批產品的變異性、在生產工藝或設備變更后產品質量一致性測試，并為仿制藥處方設計提供有用的反饋。它可以在未來用于潛在建立這些制劑的體外釋放行為與體內藥代動力學之間的相關性。
2.1 化學品和試劑
多柔比星購自SHJNJ PharmaTech（中國上海）和LC實驗室（Woburn，MA）。脂質組分：氫化大豆磷脂酰膽堿 (HSPC)；1-棕櫚酰基-2-油酰基-Sn-甘油-3-磷酸膽堿 (POPC)；1,2-二硬脂酰-Sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-氨基（聚乙二醇）-2000 銨鹽（DSPE-PEG2000）購自Lipoid（紐約），膽固醇購自AvantiPolar Lipids（Alabaster）。Doxil?是從密歇根大學醫院藥房購買。β-環糊精（β-CD）和羥丙基環糊精（HP-CD）由Roquette Pharma贈送。此外，HP-CD、β-CD和β-CD購自SHJNJ Pharmatech（中國上海）。NH4HCO3從Sigma購買。Float-a-lyzer?（截留分子量為10-300kDa）透析管購自Spectrum Laboratories。蔗糖購自Fluka。所有其他試劑均為分析級，從Sigma購買。為確保定量分析和釋放試驗的準確性，本研究中使用的所有緩沖液在使用前立即新鮮制備。
2.2 方法
2.2.1 多柔比星脂質體的制備
將HSPC、膽固醇和DSPE-PEG2000以3:1:1的重量比（表I）溶解在1mL乙醇（EtOH）中，制備脂質溶液。對于POPC -脂質體制備，用等量POPC取代HSPC（表I）。將混合物加熱至65℃，直至所有固體完全溶解。通過向硫酸銨溶液中加入脂質形成多層脂質體（MLVs）（脂質加成法）。具體而言，將脂質/乙醇溶液倒入65℃攪拌的0.25M 硫酸銨溶液（L-DOXp）中，或高壓注入65℃攪拌的0.25M 硫酸銨溶液（L-DOXi）中，并在相同溫度下攪拌十分鐘，然后擠出。隨后以相同的方式處理MLVs以制備L-DOX。簡言之，將Lipex擠出機（Northern Lipids, Burnaby, BC, CA)加熱至65℃，并在添加MLVs之前用0.25M 硫酸銨溶液沖洗。在擠出機中加熱MLVs 1分鐘后，壓力增加，直到出口管保持恒定流量。在室溫下，通過動態光散射（DLS, ZetaSizer 3000HSa）測量，重復擠出大約六次，直到脂質體平均直徑在85-90nm之間且多分散度（PDI）小于0.1。H-DOX通過與L-DOXp相同的方式形成MLVs，然后使用微射流機（(Microfluidics M-110P, Microfluidics, Westwood, MA）進行高壓均質化，特別是在10000-15000psi下進行兩次均質化。通過透析法（4℃）在5 mM HEPES，10% w/v蔗糖（pH 6.5）條件下將脂質體從硫酸銨中分離。
為了將多柔比星裝入脂質體中，將鹽酸多柔比星（DOX?HCl）粉末以10mg DOX?HCl/mL的濃度溶解在5 mM HEPES，10% w/v蔗糖（pH 6.5）中，然后以0.125 g DOX/g脂質的比例加入脂質體。將混懸液混合并60℃加熱1小時，然后在冰水中冷卻至少15分鐘。未載入的多柔比星（DOX）通過對組氨酸1.55g/L、蔗糖94g/L（pH6.5）透析（4℃）從L-DOX中分離。所得脂質體制劑通過0.2μm注射器過濾器(聚醚砜)過濾，稀釋至2.0mg DOX?HCl/mL，并在4℃下儲存直至使用。
2.2.2 多柔比星脂質體的分析
采用HPLC法測定了不同脂質體制劑中DOX的最終濃度。在HPLC樣品制備中，用990μL甲醇加入10μL多柔比星脂質體液相小瓶進行稀釋。渦旋混合以破壞脂質體并溶解脂質體組分。配有等度泵和紫外檢測器的高效液相色譜儀（Agilent 1100）進行分析。Zorbax eclipse XDB-C8柱（4.6 ? 150 mm, 5μm）用于分離并配備了C18反相鍵合硅膠柱（KJO-4282）和Cartridges C-8（AJO-4290），在254nm處檢測DOX。流動相包括0.1% v/v三氟乙酸(TFA)水溶液(A)和0.1% v/v TFA甲醇溶液(B)。流動相以1.0 mL/min的流速在12分鐘內以40%至100%流動相B輸送，柱溫30℃，進樣體積為10μL。
使用等度泵、紫外可見檢測器和蒸發光散射檢測器（ELSD）HPLC（Agilent 1100）對膽固醇、磷脂和溶血素-PC濃度進行了分析。Zorbax eclipse XDB-C8柱（4.6 ? 150 mm, 5μm）用于分離，并配備了C18反相鍵合硅膠柱（KJO-4282）和Cartridges C-8（AJO-4290）。使用紫外-可見光檢測器在205nm處檢測膽固醇，通過ELSD分析磷脂，將其設定為以下條件：蒸發器溫度為50℃，霧化器溫度為88℃，氮氣氣體流速為1.0 L/min，光電倍增管為10，平滑度為5。高效液相色譜泵程序由以下條件組成：流動相為0.1% TFA水溶液（A）和0.1% TFA甲醇溶液（B），在91% B下等度洗脫，流速為1.0 mL/min；進樣體積為20μL，柱溫50℃；運行時間30分鐘。以HSPC的mol%報告溶菌素-PC含量，定量限為HSPC的0.2mol%。使用標準磷酸鹽測定法分析脂質體中的HSPC和PEG-DSPE含量。
使用MalvernInstruments ZetaSizer 3000HSa，通過動態光散射測定了室溫下的平均粒徑和多分散性，Zeta平均值在表I中報告。
2.2.3 透析裝置膜的選擇
在流池法溶出儀（推薦使用華溶DS-7CP PLUS流池法溶出系統）上裝有8-300kDa截留分子量（MWCO）的Float-a-lyzer?檢測透析管對多柔比星游離藥釋放的影響。簡言之，將1.6 ml濃度為2mg/ml的游離多柔比星貯備液（在10% w/v蔗糖和10mg組氨酸/鹽酸中，pH 6.5）置于透析管中并放入流通池池體中，并使用78.4 ml 10mM組氨酸-氫氯化物（His/HCl）、5%蔗糖和0.02%NaN3（pH 6.5）作為釋放介質（釋放介質總體積為80ml，釋放介質中的最終多柔比星濃度（CDOX）為40μg/ml）。流速和運行溫度分別設定為16ml/min和37℃。一式三份測定釋放度，結果報告為平均值± SEM。
2.2.4 DOX脂質體流池法釋放試驗的建立
使用流池法溶出儀（推薦使用華溶DS-7CP PLUS流池法溶出系統）檢測多柔比星的釋放。簡言之，將含有1.6 mL多柔比星脂質體樣品（0.5、1和2 mg/ml濃度的L-DOX）置于透析管中，然后放入流通池池體中。每個池體使用78.4 mL的釋放介質。將介質以16 ml/min的閉環系統灌注。
考察了釋放介質溫度、DOX濃度和釋放介質組成對脂質體釋放性能的影響，試驗建立階段在37℃、45℃和55℃下進行釋放研究，并使用45℃的溫度選擇其他試驗參數。在總釋放介質中以10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml的最終濃度進行釋放試驗，相當于向透析管中添加1.6 mL 0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的DOX脂質體溶液。還考察以下因素對釋放的影響：HP-CD (1.5%、5%和20% w/v)；β-CD(1.5% w/v)和γ-CD(1.5%和5% w/v)。釋放介質中的NH4+濃度變化為0，25，50和100 mM。除非另有說明，釋放介質中含有75 mM 2-（N-嗎啉代）乙磺酸以控制pH和0.02%NaN3作為防腐劑。釋放介質的初始pH為6，因為發現pH6可誘導約50%的DOX累積釋放，這足夠根據中試研究區分不同處方。在釋放實驗之前制備新鮮釋放介質。
在方法開發階段，將等量游離多柔比星溶液直接置于釋放介質中作為對照，以模擬多柔比星從脂質體制劑中完全釋放，并監測釋放的多柔比星在釋放期間UV吸收的任何變化。
釋放的累積百分比：
其中，脂質體制劑的CDOX是在特定時間點從脂質體釋放到釋放介質中的多柔比星的檢測濃度，游離多柔比星對照的CDOX是在相同時間點的游離多柔比星的檢測濃度。在所有條件下重復測定釋放度，結果報告為平均值±SEM。
2.2.5 常規釋放試驗
常規釋放試驗用于研究沒有特氟龍流通池體和管的情況下DOX的釋放。簡言之，將0.8 mL脂質體制劑（CDOX=2mg/ml）置于300kDa 透析管中，隨后放入含有39.2 mL釋放介質的50ml離心管中，總釋放介質體積為40ml，總介質中的最終CDOX為40μg/ml。將離心管置于轉速為320rpm/min的軌道振蕩器上，并在37℃下孵育。使用等量游離多柔比星溶液作為對照。在設定時間點，抽取150μL釋放介質樣品，用酶標儀在480nm紫外線檢測，并替換為等量的新鮮釋放介質。使用早期公式計算DOX釋放的累積百分比。
2.2.6 各種脂質體制劑DOX釋放的最終分析和檢測
最終優化的USP-4釋放試驗條件要求如下:(1)480 nm紫外檢測;(2)截留300kda的Float-a-lyzer?透析管;(3)每次檢測，將0.4 mL 2mg /mL DOX脂質體制劑與1.2 mL釋放介質混合，在透析管中加入共1.6 mL稀釋的脂質體溶液(0.5 mg/mL);(4)釋放介質78.4 mL(總介質濃度為10 ug/mL DOX);(5)釋放介質由5% w/v HP-CD、100 mM NH4HCO3、75 mM MES、0.02% NaN3和5% w/v蔗糖(pH 6)(簡稱5% HP-CD碳酸氫銨、MES、NaN3、蔗糖(AMNS))組成;(6)流速16 mL/min;(7) 溫度45℃。
對各種DOX脂質體制劑進行了重復三次分析，并繪制了平均累積釋放量和SEM圖。通過f2試驗，使用以下公式評估不同處方的DOX釋放曲線之間的相似性或差異：
其中，n是時間點的數量，Rt是在時間t(t > 0)的參比批次的累積釋放值，Tt是測試批次在時間t(t > 0)的累積釋放值。所有時間點的累積釋放值（n=24）用于計算f2。相似系數f2 ≥50被認為與參比處方相似。
為了確定每天的變異性，在三個不同的日期分析相同的樣品；每天重復三次。報告了7小時和24小時多柔比星累積釋放的平均值、SEM和方差。還計算并報告了f2。
3.1 多柔比星脂質體的制備與表征
制備了組成與Doxil?相同的脂質體制劑，并對其進行了表征，用于流池法藥物釋放試驗開發。在表I中總結了組成、制備脂質體所用的方法及其分析特性的差異。脂質體的平均大小和多分散性指數(PDI)通過DLS測量，并且在表I中報告了Zeta平均值。通過不同HPLC方法測定了脂質體的多柔比星、溶血素-PC和膽固醇含量。用標準磷酸鹽測定法測定磷脂含量或HSPC和DSPE-PEG2000的總和。總脂是磷脂和膽固醇含量的算術均值（表1）。
L- DOXp和L-DOXi的MLV制備方法有所不同。L-DOXP為將含脂乙醇溶液倒入攪拌下的硫酸銨水溶液中，L-DOXi為高壓注入。雖然L-DOXi和L-DOXp的平均尺寸和多分散性非常相似，但L-DOXp釋放DOX速度更慢，如下文所述。為了進一步研究生產工藝對多柔比星釋放的影響，我們采用均質法制備了脂質體。與擠出制備的脂質體相比，所得脂質體的平均粒徑略小，PDI更高。通過均質制備的脂質體釋放DOX比擠出制備的脂質體更快。為了研究流池法試驗是否能夠區分緩釋和快速釋放制劑，我們用等量的POPC取代HSPC制備了脂質體。POPC熔融溫度（-2℃）比HSPC（53℃）低，因此預計DOX會更快釋放。雖然HSPC替代POPC略微改變了脂質與DOX的摩爾比，但質量比保持不變。
3.2 透析裝置膜的選擇
透析袋/透析管可用作屏障，使釋放的多柔比星快速擴散到釋放介質中，同時保留仍包封在脂質體中的所有多柔比星。為了找到能夠滿足這一要求的特定透析袋/管膜，通過在透析袋中直接添加游離多柔比星溶液來測試具有不同MWCO和材料的膜，以模擬所有藥物分子從脂質體中釋放的條件。
結果表明，采用100-300kDa MWCO的Float-a-lyzer?CE膜可快速釋放多柔比星，在37℃下的7h內釋放幾乎100%的多柔比星，而采用8-10kDa MWCO的膜在24h內僅觀察到33.9% ±2.2%的累積釋放（見圖1)，100和300kDa MWCO膜的DOX轉運速率無顯著差異，因此所有后續研究均使用300kDa MWCO膜。100-300kDa MWCO膜的孔徑范圍為5-8nm，比我們的脂質體粒徑小得多。因此，仍包封在脂質體中的多柔比星不會穿過膜。此外，釋放24小時后，在釋放介質中未檢測到脂質體，HPLC檢測沒有磷脂即可證明這一點。
3.3 多柔比星釋放試驗初步開發
3.3.1 解決釋放介質中的DOX沉淀問題
在確定了游離多柔比星的適當透析膜后，在SOTAX ?流池法溶出儀上進行了多柔比星從脂質體的釋放試驗。建立了游離DOX溶液在各種釋放介質中0-45μg/ml的標準曲線，包括10mM His/HCl和5%蔗糖（pH=6.5）、PBS（pH=7.4）和100 mM NH4HCO3/5%蔗糖（pH 6.0）。使用進化陣列紫外可見分光光度計480nm檢測DOX，并在0-45μg/mL濃度范圍內觀察到所有介質的良好線性。初步藥物釋放，在介質100mM NH4HCO3（5% 蔗糖，pH6）（圖2a）或PBS（pH7）中以40μg/mL總DOX濃度進行實驗，意外的是，在SOTAX ?流池法溶出儀的兩種介質中均觀察到DOX沉淀。進一步的研究表明，溶出儀的聚四氟乙烯表面形成了較小的紅色晶體，隨著時間的推移，其尺寸逐漸增大，最終導致多柔比星沉淀。為了探索儀器特氟隆表面或釋放介質中的有限DOX溶解度是否為藥物沉淀的原因，在聚丙烯離心管中進行釋放(參見常規釋放試驗) 。在無聚四氟乙烯條件下，DOX沉淀的程度也較小。在離心管中加入特氟隆攪拌棒時，即使在DOX濃度低至3μg/ml下，也觀察到在特氟隆表面上形成紅色沉淀。為了避免在流池法溶出儀系統中釋放期間沉淀，我們將羥丙基環糊精(HP-CD)作為DOX溶解度增強劑添加到釋放介質中。
添加1.5%、5%和20%時，HP-CD可提高DOX在釋放介質中的溶解度。在向釋放介質中添加HP-CD之前和之后，使用常規測定進行釋放研究，48小時內未觀察到DOX沉淀。在常規分析中添加特氟龍表面并在介質中加入HP-CD不會導致多柔比星沉淀（圖2b）。初始釋放實驗在37℃下于PBS，10mM his/HCl緩沖液或100mM NH4HCO3中進行，然而，僅在NH4HCO3緩沖液中觀察到脂質體釋放DOX。此外，DOX釋放百分比在pH5-7之間高度依賴于NH4HCO3溶液pH。發現pH6 介質在24小時內誘導DOX的累積釋放約50%，這足以區分基于中試研究的不同處方。然而，在37℃下釋放DOX期間，100mM NH4HCO3/5% w/v蔗糖介質的pH從6增加至8，導致多柔比星的紫外吸收降低，這降低了分析準確度。此外，在含蔗糖的介質中觀察到細菌生長。為避免pH在釋放過程中增加，在釋放介質中加入緩沖至pH6.0的75mM MES。在釋放介質中加入75mM MES后，pH的變化非常適中，37℃下48h后，pH由6增加至6.2，DOX紫外吸收保持不變。向釋放介質中添加防腐劑0.02% w/v NaN3可防止細菌生長。因此，我們選擇了含NH4HCO3、MES和NaN3的釋放介質進行進一步評估。我們將此介質縮寫為“AMNS”（碳酸氫銨、MES、NaN3、蔗糖）。然而，即使在存在100mM NH4HCO3的情況下，通過常規釋放試驗（圖2b），在37℃下24小時內DOX的釋放程度有限僅約7%，因此需要探索增加釋放速率的額外措施。隨后進行的實驗考察溶出系統溫度對其釋放的影響。
3.3.2 流池溶出系統溫度對DOX釋放的影響
多柔比星的釋放與溫度高度相關，7小時內多柔比星累積釋放百分比為91.0%±1.6%、42.4%±0.6%和4.5%±0.1%的試驗溫度分別為55℃、45℃、37℃（圖2c）。DOX脂質體主要組分HSPC的凝膠-液晶相變溫度(Tm)為53 ℃。當溫度高于Tm時，釋放量顯著增加，這不足為奇。選擇45℃的溫度進行后續研究，因為L-DOXi的累積釋放百分比幾乎在24小時內就可以釋放完全（95.3% ±1.2%），但釋放速率足夠慢，可以區分處方之間的差異。
3.3.3 流池法溶出儀釋放試驗的優化
3.3.3.1 不同濃度L-D0X對DOX釋放的影響
考察了L-DOX制劑與總釋放介質的體積比對流池法中DOX釋放速率的影響。L-DOX的標準濃度為2mg/ml。將L-DOX稀釋至0.5、1和2mg/ml的濃度，并將1.6ml稀釋的L-DOX置于Float-a-lyzer?透析管中，將透析管插入流通池體中，并向每個釋放管路中添加78.4ml的釋放介質。因此，100%的多柔比星釋放會在總釋放介質中產生10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml的藥物濃度。初始L-DOX濃度越低，多柔比星累積釋放越高：分別在24h內釋放了77.0% ±2.7%、60.9% ±0.6%和48.3 ±0.7%的mL（圖3a），由于多柔比星檢測最低濃度是精確的儀器中的濃度和多柔比星沉淀風險在最低濃度下較低，所有后續研究均使用總介質中的10μg/ml的多柔比星濃度（透析管中多柔比星濃度為0.5mg/ml）。
3.3.3.2 環糊精類型和濃度對DOX釋放的影響
考察釋放介質中HP-CD濃度對DOX釋放的影響。含1.5%、5%和20% HP-CD的釋放介質的累積藥物釋放沒有顯著差異（對于1.5%的HP-CD和5%的HP-CD，f2為53.1；對于1.5%的HP-CD和20%的HP-CD，f2為52.7；對于5%的HP-CD和20%的HP-CD，f2為68.7）（圖3b），在含有5%和20% HP-CD的釋放介質中未檢測到多柔比星沉淀，但在使用1.5%HP-CD時出現微量沉淀。
為了比較環糊精類型對DOX釋放的影響，將1.5%γ-CD、β-CD或HP-CD添加到含有100mM NH4HCO3、75mM MES、5%蔗糖和0.02%NaN3的釋放介質中。由于β-CD的水溶性有限，實驗在1.5%環糊精介質濃度下進行。與HP-CD和β-CD相比，γ-CD的DOX釋放更快（圖3c）。不幸的是，當三種環糊精僅在1.5%濃度下使用時，都觀察到DOX的微量沉淀。為了避免DOX沉淀，對含有5%γ-CD和HP-CD介質的藥物釋放進行了研究。在含5%γ-CD介質中，在7小時DOX累積釋放為89.5% ±3.1%，而含5%HP-CD介質中的累積釋放為42.4% ±0.6%（圖3d）。對于5%γ-CD釋放介質，DOX釋放太快，可能會降低區分不同L-DOX制劑的能力。此外，與HP-CD相比，γ-CD輔料成本更高，因此在釋放試驗中使用γ-CD是不切實際的。因此，在優化的釋放試驗中使用了5%HP-CD。
3.3.3.3 NH4+對多柔比星釋放的影響
在流池法溶出儀上研究了釋放介質中NH+濃度對DOX釋放速率的影響。NH4HCO3釋放介質濃度對DOX釋放有顯著影響（圖4)，在沒有NH4HCO3的情況下，DOX釋放非常有限，釋放速率隨NH4HCO3濃度的增加而增加。因此，100mM NH4HCO3釋放介質用于后續研究。
根據實驗結果，確定了DOX脂質體的流通池法釋放試驗方法。優化后的釋放介質組成為100mM NH4HCO3、75mM MES和5%HP-CD、5%蔗糖和0.02%NaN3（pH6）。在45℃下以16ml/min的速度循環釋放介質，24小時檢測DOX釋放，釋放介質體積為80ml，總釋放介質中DOX的最終濃度為10μg/ml，相當于向透析管（Float-a-lyzer?）中添加1.6ml濃度為0.5mg/ml的DOX脂質體。
3.3.3.4 釋放試驗的有限確認
通過使用相同的L-DOXi制劑在三個不同的日期運行釋放試驗，通過前述優化的流池法溶出儀進行釋放試驗，分析了日間變異性。7小時和24小時的累積釋放量分別為47.0%±1.6%和96.5%±0.7%，表明測定方差有限，釋放曲線無顯著差異（第1天和第2天的f2為73.4，第1天和第3天的f2為63.4，第2天和第3天的f2為81.0）（圖5)，對照DOX溶液的UV強度變化在四個不同的日期進行評估。
3.3.3.5 脂質體組成和制備方法對DOX釋放的影響
為驗證已建立的流池法釋放試驗區分DOX釋放的能力，檢查了各種脂質體制劑的差異（圖6)。將市售的Doxil?作為對照進行分析。用POPC替代HSPC可在10小時內快速完全釋放DOX（圖6a）。所有其他脂質體的組成與Doxil?相同，但其理化性質略有不同。通過f2計算定量評估了這些處方之間的DOX釋放差異（表2）。當f2值大于50時，認為兩種處方的釋放曲線相似。在表2中列出的多項比較中，這些比較的f2值小于50，并且認為它們的DOX釋放行為彼此不同。
我們制備的所有制劑的DOX釋放速率均低于市售Doxil?。在制備的脂質體中，使用高壓均質(H-DOX)制備的脂質體比L-DOXp表現出更快的釋放速率，24小時累積釋放分別為82.9%±0.3%和77.7%±1.3%（圖6a）。與L-DOXp平均粒徑為91.0±0.1 nm相比，H-DOX（79.4±0.3 nm）的平均粒徑更小，粒徑分布更寬。H-DOX粒徑的非均勻性可以解釋DOX釋放速率的加快。
在脂質體擠出之前制備MLV的方法也對DOX釋放有影響。在硫酸銨水溶液中倒入脂質溶液制備的MLVs（L-DOXp）的DOX釋放比在水溶液中高壓注入脂質溶液制備的MLV（L-DOXi）要慢。此外，釋放介質中存在環糊精和NH4HCO3不會導致以顆粒粒徑發生劇烈變化為特征的脂質體崩解。在釋放過程中，脂質體保持完整，并且僅進行了有限的顆粒尺寸增加（表2）。
選擇釋放介質是成功開發流池法釋放試驗的關鍵。雖然低離子強度介質10% 蔗糖和10mM his/HCl（pH 6.5）可以很好的溶解游離多柔比星，且不會引起明顯沉淀，但該釋放介質不能誘導多柔比星從脂質體中釋放。同樣，單獨使用PBS也不會誘導多柔比星釋放。近年來，有報道稱腫瘤細胞可以通過谷氨酰胺分解產生氨，并誘導多柔比星從脂質體中釋放出來。我們的初步研究還發現，當添加NH4+到釋放介質中時，多柔比星的累積釋放顯著增加。此外，脂質體釋放的多柔比星高度依賴于釋放介質的pH和NH4+濃度。在100mM的相同NH4+濃度下，當釋放介質的pH從4.5增加到7.0時，脂質體釋放的多柔比星累積百分比從0%增加到80%， 同樣，當釋放介質中的NH4+濃度從0增加到100mM時，多柔比星累積釋放百分比也會增加，這并不奇怪，因為多柔比星通過硫酸銨梯度法被加載到脂質體中，并且多柔比星可以在脂質體內硫酸鹽存在下形成晶體。多柔比星作為游離有機堿，對脂質體的脂質雙分子層具有高滲透性，但當其質子化并因此被捕獲在脂質體內時，則具有低滲透性。氨鹽在釋放介質中pH依賴性分解后，NH3能夠穿透脂質體膜，去質子化多柔比星，并促進其通過脂質膜的轉運，當氨在增加pH被中和時，釋放介質中的氨變得更通透。因此，較高的pH和較高的NH4+濃度可誘導更多的多柔比星釋放。
然而，當使用含NH4+的釋放介質進行釋放測定時，多柔比星會沉淀在流通池體和特氟隆管路，即使在低至3μg/ml的多柔比星濃度下，聚四氟乙烯的管路也會導致沉淀。為了避免釋放的多柔比星沉淀，HP-CD可以通過將客體分子封裝在空腔中，將其溶解到釋放介質中，因此，添加HP-CD后未發生沉淀。然而，在釋放介質中使用環糊精通過不同的機制增強了多柔比星釋放，環糊精能夠從脂質體膜中提取膽固醇，從而提高膜的流動性和通透性。24小時釋放研究完成后，對脂質體中殘留膽固醇含量的HPLC分析以及釋放介質的分析證實，有30%的膽固醇離開脂質體，并在5%HP-CD釋放介質中也有發現。在血漿中，可能發生與循環脂蛋白從注射的脂質體中提取膽固醇類似的事件。
解決沉淀問題后，進一步優化該釋放試驗，以便在24小時內幾乎完全釋放多柔比星，從而提高試驗的區分能力，因而評估了釋放介質中的多柔比星濃度、釋放介質組成以及溫度的影響。溫度越高，多柔比星釋放速率越快，這并不奇怪，因為在更高的溫度下，脂膜的流動性越高，膜的流動性有助于銨離子進入脂質體，多柔比星從脂質體中擴散出來，以及環糊精提取膽固醇。此外，在較高的溫度下，NH3的生成速率較高，有效的多柔比星溶解度、擴散和解離常數較高，從而加快了分子的遷移和反應性。然而，過高的釋放速率（55℃）或過低的釋放速率（37℃）可能會掩蓋不同制劑之間的任何輕微差異，因此，使用中等釋放速率（45℃）作為釋放試驗的溫度，這為區分不同制劑提供了更好的機會。
流池法測定的主要局限性在于測定條件本身確定了脂質體釋放多柔比星的驅動力。因此，該試驗可主要用于確定多柔比星脂質體制劑之間的相對差異，而不是確定體內相關釋放行為。似乎NH4HCO3的存在和pH依賴性形成是溶解和釋放多柔比星的關鍵驅動力。即使所有其他參數（如HP-CD和高溫）保持不變，在小于25 mM NH4HCO3時觀察到幾乎沒有多柔比星釋放（圖4）。L-DOX濃度分別為10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml時，加快的多柔比星釋放速率降低，這也歸因于多柔比星-硫酸鹽溶出期間透析管內NH4HCO3與多柔比星脂質體的比率較高和瞬態pH變化。雖然可以使用相同數量的NH3溶解多柔比星脂質體，但隨后，它會溶解較高比例的總多柔比星，從而導致更完全的藥物釋放。
溫度對釋放速率也有明顯的影響（圖2c）。在含有HP-CD、MES和100 mM NH4HCO3的所有相同介質中，在37℃下幾乎沒有觀察到多柔比星釋放，在55℃下快速且幾乎全部的藥物釋放在6h內達到平臺，與在45℃下持續釋放多柔比星形成對比。在55℃下，脂質體膜類似流體，因此多柔比星可以通過膜快速擴散，釋放介質中HP-CD的存在有助于去除脂質膜中的膽固醇，減少膜的有效過渡，并提高多柔比星滲透性。顯然，試驗溫度顯著影響多柔比星的有效釋放速率，最終選擇的流池法參數與生理條件相差甚遠。然而，加速釋放條件已被其他研究者用于建立基于流池法的聚合物微球評估方法。在流池法試驗中，使用pH2.4的極端釋放介質pH、添加10% 乙醇以及45℃、50℃、53℃和60℃的高溫來區分聚合物微球處方。
除釋放介質組成和溫度外，流池法釋放裝置的設置本身也會影響多柔比星釋放。為了檢測脂質體的藥物釋放，我們使用了透析裝置插入USP-4裝置。我們發現，透析膜代表了多柔比星從Float-a-lyzer ?擴散到USP-4流通池的擴散屏障，值得注意的是，高滲透性300 kDa透析管的釋放存在滯后時間，這使我們對釋放動力學的有效觀察延遲了大約1小時（圖1中50%釋放的時間約為1小時）。因此，由于脂質體制劑的釋放是在更長的時間尺度上觀察到的(例如，半時間約7小時)，我們正在觀察藥物從脂質體釋放的動力學有價值的表現（圖5)。然而，使用其他滲透率較低的50-10kDa透析膜會導致多柔比星溶液從Float-a-lyzer?中釋放顯著減慢和不完全釋放。這種影響可能取決于藥物的大小和疏水性，因此，對于難溶、分子量較大的藥物，這種影響可能更為嚴重。
選擇用于分析的最終條件與L-DOX的生理釋放條件相去甚遠。USP-4試驗條件的主要優化標準是在12小時內從Doxil?中觀察到超過80%的藥物釋放，以便能夠在試驗持續時間的24小時內區分具有更快或更慢多柔比星釋放行為的脂質體制劑。實際上，當使用優化的釋放試驗來確定不同L-DOX制劑的釋放曲線時，它能夠區分慢釋放和快釋放脂質體制劑。例如，POPC L-DOX的釋放速率比任何其他制劑都快，在10h內釋放幾乎100%的多柔比星。這并不奇怪，因為POPC的相變溫度遠低于其他脂質體制劑。相變溫度較低的磷脂具有較高的流動性，這使得分子更容易通過脂質雙層運輸。我們還發現，組成相同但通過不同方法制備的制劑，以及具有略微不同理化性質的制劑，在體外表現出非常不同的釋放，均質脂質體具有更寬的粒徑分布（表1），與擠出制備的脂質體相比，多柔比星釋放更快。通過均質化縮小MLVs粒徑的工藝不能實現與擠出相同的粒徑控制。脂質體粒徑分布越大，某些脂質體的釋放速率越快。MLV制備方法似乎對多柔比星釋放速率有很大影響，因為L-DOXi的藥物釋放比L-DOXp快。脂類或硫酸銨的層狀排列可能存在差異，有些脂質體或小粒徑非均勻性低于DLS檢測能力，需要通過對不同脂質體的顯微鏡分析進一步解釋這種差異。
雖然未進行正式的分析驗證，但有限的確認顯示，在不同日期（圖5）對同一L-DOX制劑進行的分析變異性較低，多柔比星溶液對照信號強度的日間變異性較低。然而，我們發現多柔比星釋放速率強烈依賴于NH4HCO3溶液的離子強度和介質的初始pH。這可能與藥物非臨床試驗質量管理規范(GLP)的含量驗證存在潛在問題，因此，可能需要進一步優化氨鹽濃度和pH，以提高分析耐用性。此外，在每次USP-4儀器運行中使用L-DOX標準制劑作為對照，并以與對照的百分比差異表示釋放度結果，這可以在GLP分析驗證中實施。
我們研究中采用的設計原理和選擇適當釋放條件的方法可能是開發其他通用復合脂質體制劑分析的有用范例。
使用含100 mM NH4HCO3、5%蔗糖、75mM MES、0.02%NaN3和5%HP-CD的釋放介質，在45℃下用流池法溶出儀進行24小時的多柔比星脂質體釋放試驗。該釋放試驗用于區分不同工藝制備的相似多柔比星脂質體的差異。已建立的流池法試驗可用于區分原研和仿制多柔比星脂質體之間的可能差異，為設計更好的制劑提供有用的反饋，并可能將這些制劑的體外釋放行為與體內藥代動力學聯系起來。
略
如需原文，請聯系小編 (代老師15012941165)
